Pretratamiento de muestras
Adquisición espectral
Las muestras se analizan mediante microscopía Raman dentro de un área representativa de submuestreo, definida por el límite espacial de detección (tamaño mínimo de partícula). Cada muestra se somete a microscopía Raman automatizada durante 12 a 24 horas, generando datos espectrales y morfológicos de decenas de miles de partículas individuales. Las mediciones Raman se realizan a 20 °C utilizando un Horiba LabRAM Soleil (Jobin Yvon, Francia). Las muestras se excitan al 8 % (7,2 mW) de potencia con un láser de diodo He–Cd de 532 nm refrigerado por aire de alta estabilidad, y un objetivo Nikon LV-NUd5 100×. El haz láser confocal no polarizado proporciona una resolución lateral de aproximadamente 1 µm. Los espectros se recogen en el rango de 200 a 3400 cm⁻¹ utilizando una red de difracción de 600 líneas/cm con una rendija de 100 µm, logrando una resolución espectral de aproximadamente 1 cm⁻¹. El análisis de partículas en cada mosaico, construido con la configuración SmartView del software LabSpec6 (LS6), se realiza mediante la aplicación Particle Finder V2. SmartView determina la topografía (±50 µm), guarda los puntos focales de todas las partículas en la micrografía y permite reenfocar rápidamente el escenario sobre las partículas relevantes.

Comparación y verificación espectral
Utilizando el software de análisis espectral Spectragryph V1.2.17d (Dr. Friedrich Menges SoftwareEntwicklung, www.effemm2.de/spectragryph), los espectros crudos se procesan con corrección adaptativa de la línea base con una rugosidad del 15 %. Los espectros procesados se comparan en todo su rango espectral utilizando una biblioteca interna que contiene espectros seleccionados de las bibliotecas SLoPP y SLoPP-E (Munno et al., 2020) y la biblioteca de Cabernard (Cabernard et al., 2018), junto con espectros poliméricos obtenidos internamente. Las coincidencias espectrales se evalúan utilizando un índice de calidad de coincidencia (HQI, por sus siglas en inglés) que varía entre 0 y 100 %. Los espectros con valores de HQI superiores al 65 % se clasifican como candidatos a microplásticos y son inspeccionados y validados manualmente por un intérprete capacitado.

Corrección de falsos positivos (partículas particionadas involuntariamente)
Debido al proceso de adquisición cuadro por cuadro necesario para obtener mediciones Raman precisas de microplásticos de hasta 1 µm de diámetro, las partículas situadas en los bordes de un cuadro (partículas de borde) a menudo se particionan y se identifican erróneamente como múltiples partículas. A la resolución microscópica actual, cada cuadro mide 60 × 40 µm, lo que conlleva una sobreestimación de las fracciones de tamaño más pequeñas y una subestimación de las partículas más grandes. Aunque la aplicación LS6 Particle Finder incluye una opción para excluir partículas de borde, este enfoque elimina de forma desproporcionada partículas grandes, que son más propensas a intersectarse con el borde del cuadro, lo que conduce a una subestimación de la concentración real de microplásticos. Para abordar esto, se desarrolló un script personalizado (Microplastic Solution, Francia) para mejorar el procesamiento posterior de datos fusionando microplásticos particionados involuntariamente. Aunque el código no puede compartirse por razones comerciales, se divulgan sus funciones principales. El script calcula la distancia entre partículas del mismo tipo de polímero para identificar superposiciones, definidas como una distancia entre centros de partículas menor que el eje mayor de una de ellas. Las partículas superpuestas se agrupan y se designa como “líder” a aquella con el valor HQI más alto. El índice del líder define la nueva partícula fusionada, que hereda el área acumulada del grupo, mientras que las demás partículas se descartan. El diámetro de la partícula fusionada se calcula como el diámetro equivalente en área, asumiendo una forma circular.

Controles de calidad negativos y positivos Control en blanco y corrección
Para garantizar resultados fiables, se realiza un experimento de control en blanco para estimar y corregir la contaminación introducida durante el pretratamiento de la muestra. Se prepara una solución libre de contaminación y se trata conforme al mismo protocolo que las muestras reales. Durante el análisis, las partículas identificadas en el blanco se caracterizan cuidadosamente según su tipo de polímero y tamaño. La corrección en blanco se realiza comparando los microplásticos de la muestra con los del blanco. Las partículas se emparejan si comparten el mismo tipo de polímero y sus tamaños están dentro de un rango definido. Una vez emparejadas, la partícula correspondiente en la muestra se resta, y la partícula coincidente del blanco se excluye de futuras correcciones. Este proceso garantiza que la contaminación procedimental se tenga en cuenta con precisión sin sobrestimar su impacto. La corrección se aplica de forma uniforme a todas las muestras, con porciones equivalentes del área del filtro analizadas para mantener la coherencia. Este enfoque permite identificar y restar eficazmente la contaminación, asegurando la validez de los resultados. Se proporcionan tanto los datos corregidos como los no corregidos por blanco.

Control de recuperación y corrección
Para tener en cuenta la pérdida involuntaria de microplásticos durante el pretratamiento, se realiza un experimento de recuperación mediante el uso de fragmentos de polietileno (PE) rojos EasyMP™ (Microplastic Solution, Francia). Se añaden cantidades conocidas de estos fragmentos ambientalmente relevantes a muestras de prueba, que luego se procesan utilizando el mismo protocolo que las muestras reales. Tras el procesamiento, se evalúa el número restante de microplásticos añadidos para determinar la tasa de recuperación analítica. Los fragmentos EasyMP™ permiten evaluar la recuperación en diferentes rangos de tamaño, proporcionando información sobre tendencias como una menor recuperación para partículas grandes y, en algunos casos, una recuperación mayor de lo esperado para partículas pequeñas debido a una posible fragmentación durante el pretratamiento. Con base en estos hallazgos, se desarrolla un modelo matemático que describe la relación entre el tamaño de partícula y la tasa de recuperación. Este modelo se aplica posteriormente para corregir la recuperación analítica de todos los microplásticos detectados dentro de cada grupo de tamaño, garantizando una cuantificación precisa de los microplásticos en las muestras procesadas.